免疫沉淀試劑盒（離心柱法）
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貨號
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名稱
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規(guī)格
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RTD9201
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免疫沉淀試劑盒（離心柱法）
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20次
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● 產(chǎn)品簡介：
免疫沉淀（Immunoprecipitation）是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于通過特定抗體捕獲目標(biāo)抗原（蛋白質(zhì)）。該產(chǎn)品使用小于10 μg的抗體即可高效地實現(xiàn)抗原免疫沉淀。首先將特異性抗體加入樣品中形成免疫復(fù)合物，然后將免疫復(fù)合物加到Protein A/G 瓊脂糖樹脂中形成Protein
A/G-抗體-抗原復(fù)合物，洗滌該復(fù)合物以除去未結(jié)合的物質(zhì)，再以變性洗脫緩沖液或低pH的酸性洗脫緩沖液將結(jié)合的免疫復(fù)合物從Protein A/G上洗脫。
該試劑盒包含確保抗原高產(chǎn)量的優(yōu)化緩沖液和高效離心柱和收集管，通過減少處理和混合時間簡化實驗步驟，能有效避免普通離心方法不易吸取上清的問題。 離心柱經(jīng)過優(yōu)化處理，可以使用少至20 μl的Protein
A/G樹脂。
特別提示：試劑盒配套的IP裂解緩沖液含有溫和的去垢劑Triton
X-100，可以有效提取胞漿蛋白和核蛋白。然而對于部分核蛋白（如與染色體緊密結(jié)合的核蛋白）以及膜蛋白（特別是多次跨膜蛋白）提取效果不好，不建議使用該試劑盒進(jìn)行免疫沉淀。
以每次使用20
μl Protein A/G 瓊脂糖樹脂計算，試劑盒可以進(jìn)行20次IP反應(yīng)。
● 產(chǎn)品組成：
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貨號
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名稱
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規(guī)格
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貯存
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RTD9201-01
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IP裂解緩沖液
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25
ml
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4℃
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RTD9201-02
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洗滌緩沖液
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25
ml
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4℃
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RTD9201-03
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Protein
A/G 瓊脂糖樹脂
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0.4
ml
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4℃
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RTD9201-04
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酸性洗脫液
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2
ml
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4℃
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RTD9201-05
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中和緩沖液
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0.2
ml
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4℃
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RTD9201-06
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變性洗脫液
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1
ml
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-20℃
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RTD9201-07
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離心柱（含收集管）
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20套
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RT
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說明書
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-
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● 產(chǎn)品貯存、運輸及效期：
按照標(biāo)簽溫度貯存；常溫運輸；有效期一年。
● 用前必讀：
1.
除非另有說明，所有操作在
4℃下進(jìn)行。
2. 樹脂的所有離心步驟需在低速（如
1000×g）、1 min條件下操作。離心速度大于 5000× g 可能會導(dǎo)致樹脂聚集，難以重懸。
3. 離心柱離心過程中，使用2
ml離心管收集時流穿的液體體積應(yīng)不超過
600 μl，使用1.5 ml離心管
收集時則應(yīng)不超過
300 μl。體積超出可能導(dǎo)致柱內(nèi)產(chǎn)生回壓及洗滌和洗脫不完全。
4. 使用此試劑盒時抗體將與免疫沉淀的抗原一起被洗脫。因此，在還原型 SDS-PAGE 凝膠或 Western blot時至少產(chǎn)生三個蛋白條帶：抗體重鏈（ ~50 kD） 、輕鏈（~25 kD ）和抗原。如果抗體條帶掩蓋了免疫沉淀的抗原，則可用重鏈或輕鏈專一性IgG-HRP檢測目的蛋白，避免輕重鏈的干擾。
5. 為了優(yōu)化結(jié)果，盡量使用親和純化后的抗體。盡管也可使用血清，但血清樣品中針對目的抗原的特異性抗體含量可能僅占IgG 總量的
1-2%，因此，將導(dǎo)致抗原產(chǎn)量低。
6. IP 裂解緩沖液已進(jìn)行過代表性細(xì)胞類型的檢測，包括但不限于下列細(xì)胞系： HeLa， Jjurkat，K562，A431，A549，MOPC，NIH 3T3 和 U2OS。通常情況下，106的 HeLa 細(xì)胞可以產(chǎn)生約10
mg的細(xì)胞團(tuán)塊，按照~3
μg/μl的配比使用 IP裂解緩沖液（即 100 μl IP裂解緩沖液可以裂解~300
μg細(xì)胞團(tuán)塊 ）。
7. 為了獲得最佳結(jié)果，可添加蛋白酶抑制劑或/和磷酸酶抑制劑，以盡量減少細(xì)胞裂解液中蛋白質(zhì)的降解和去磷酸化。
8.
IP裂解緩沖液可兼容BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：RTP7102）。
9. 在免疫沉淀時，建議按照步驟2.2使用與捕獲抗體種屬相同的正常IgG配制相同稀釋比的工作液作為陰性對照。本試劑盒中未提供IgG，客戶請自備。
● 操作步驟：
一. 哺乳動物細(xì)胞裂解 ：
1.1 裂解貼壁細(xì)胞 ：
1.1.1
小心去除細(xì)胞中的培養(yǎng)基。
1.1.2
用 PBS清洗細(xì)胞一次。
1.1.3 將冰上預(yù)冷的 IP裂解緩沖液加入細(xì)胞中（表1）；冰上孵育 5 分鐘并間歇混勻；用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞或用移液器吹打下細(xì)胞。
表 1 不同標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)皿/板中 IP裂解緩沖液的建議添加量
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培養(yǎng)皿/板的尺寸或表面積
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IP裂解緩沖液體積
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100 cm培養(yǎng)皿
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500-1000 μl
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60 cm培養(yǎng)皿
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250-500 μl
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6孔板
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200-400μl每孔
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24孔板
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100-200μl每孔
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1.1.4 將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到微量離心管中，冰浴10-30分鐘，間歇混勻；13000
×g離心10分鐘以沉淀細(xì)胞碎片。
1.1.5
將上清轉(zhuǎn)移到一個新的微量離心管中用于進(jìn)行蛋白濃度測定和后續(xù)分析。
1.2 裂解懸浮細(xì)胞：
1.2.1將細(xì)胞懸浮液在 450 ×g下離心 5分鐘以沉淀細(xì)胞；棄掉上清。
1.2.2將細(xì)胞團(tuán)塊用
PBS重懸洗滌一次。450×
g離心 5分鐘再次沉淀細(xì)胞。
1.2.3將冰上預(yù)冷的 IP裂解緩沖液加到細(xì)胞團(tuán)塊中。每 50 μl濕重細(xì)胞沉淀體積加入
500 μl IP裂解緩沖液。注：(五百萬，5×106) Jurkat細(xì)胞，其細(xì)胞沉淀體積（PCV，Packed Cell Volume）大約為50
μl。
1.2.4 將細(xì)胞裂解液在冰上孵育10-30分鐘并間歇混勻。13000
×g離心10 分鐘去除細(xì)胞碎片。
1.2.5
將上清轉(zhuǎn)移到一個新的微量離心管中用于進(jìn)行蛋白濃度測定和后續(xù)分析。
二. 制備免疫復(fù)合物：
注：樣品用量和孵育時間取決于每個特定的抗體-抗原體系，并且可能需要優(yōu)化實驗方案以使產(chǎn)量最大化。以下方案是針對 2-10 μg 親和純化的抗體（Protein
A/G 瓊脂糖樹脂使用20
μl），且可以根據(jù)需要按比例放大。
2.1 將 2-10
μg親和純化的抗體與步驟1.2.5得到的細(xì)胞裂解液上清在微量離心管中混合，混合體積控制在300 - 600 μl。每個IP反應(yīng)總蛋白建議量是
500-1000 μg。
2.2 可選：可以使用與IP捕獲抗體種屬相同的正常IgG配制相同稀釋比的工作液，作為陰性對照。如IP捕獲抗體使用兔源抗體，陰性對照則使用兔IgG。
2.3
在 4℃旋轉(zhuǎn)孵育 1小時至過夜，以形成免疫復(fù)合物。
三. 捕獲免疫復(fù)合物：
3.1 輕旋 Protein A/G 瓊脂糖樹脂，以獲得均一的懸浮液。使用大口徑或截短槍頭取20 μl樹脂漿液加入離心柱中。將離心柱放于收集管中，1000×g
離心1分鐘，棄掉流穿液體。
3.2
用200 μl預(yù)冷的洗滌緩沖液洗滌樹脂兩次；每次洗滌后棄掉流穿液體。
3.3 將步驟2.3的免疫復(fù)合物樣品加入含有Protein
A/G 瓊脂糖樹脂的離心柱中，蓋上管蓋溫和地上下翻轉(zhuǎn)常溫孵育 1 小時。
3.4 將離心柱置于一干凈的2
ml離心管中（自備）。1000×g
離心1分鐘并保留流穿液體。
注：在確定
IP反應(yīng)成功之前不要丟棄該液體。
3.5 將離心柱置于一個新的1.5
ml離心管中(自備)，加入200 μl
洗滌緩沖液，1000×g
離心 1 分鐘，棄流穿液。
3.6
重復(fù)步驟3.5二次。
四. 洗脫免疫復(fù)合物：
注：有兩種方案可以洗脫免疫復(fù)合物。變性緩沖液洗脫適用于 Western blot 分析；酸性洗脫液適用于酶法或功能測定。
4.1
變性洗脫液洗脫：
4.1.1 將含有樹脂的離心柱置于一個新的1.5 ml離心管中（自備），加入50
μl 變性洗脫液，在95℃下孵育10 分鐘。
4.1.2 1000×g 離心1 min，收集洗脫液。
注：加熱含有變性洗脫液的樹脂后，該樹脂將不能被重復(fù)使用且必須丟棄。
4.2
酸性洗脫液洗脫：
4.2.1 將離心柱置于一個新的1.5 ml離心管中（自備），加入
50 μl酸性洗脫液。在常溫下孵育
10分鐘。1000×g
離心1min，收集洗脫液。
4.2.2 為了中和低pH 值的酸性洗脫緩沖液（例如為了進(jìn)行下游的酶法或功能測定），洗脫后立即向洗脫液中加入1/10體積中和緩沖液，如50 μl洗脫液加入5 μl中和緩沖液，混勻。
● 實驗示例：
1 制備免疫復(fù)合物：
GAPDH-IP：5 μl GAPDH兔單抗加400μl（640 μg）K562總蛋白（1.6
μg/μl），4度 混勻1h
IgG-IP：1 μl兔IgG加400 μl（640 μg）K562總蛋白（1.6
μg/μl），4度 混勻1h
2 捕獲免疫復(fù)合物：
取20 μl Protein A/G加入離心柱中，1000g
min；100 μl
IP裂解液洗滌兩次；
將免疫復(fù)合物上柱，RT 混勻1h，形成Protein
A/G-Ab-An復(fù)合物；200 μl 1×TBS洗滌柱3次
3 洗脫免疫復(fù)合物-變性洗脫：
用干凈的1.5ml 離心管做收集管，柱子中加入50
μl 變性洗脫液，95度 10 min；1000g
1min，收集管內(nèi)為待測樣品；IgG-IP
上樣10 μl，GAPDH-IP
上樣5，10，15 μl。
Input為IP裂解液提取K562總蛋白，5×BME配制成1μg/μl上樣液，上樣10
μl（10 μg）
4 電泳：4-20% 梯度膠
200V 50min
5 轉(zhuǎn)膜：Turbo快速半干轉(zhuǎn)，濾布，0.22
NC膜，恒流1.3A
10min。
6 快封：快速封閉液（WR5020 ）RT封閉10min
7 檢測：兔GAPDH單抗1：5000
RT 1h，羊抗兔IgG-HRP
1：5000
RT 1h，ECL 1秒