BCA蛋白濃度測定試劑盒
BCA Protein Assay Kit Ver.751259-2.0
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貨號
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名稱
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規(guī)格
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RTP7102
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BCA蛋白濃度測定試劑盒
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50次（試管法）
500次（微板法）
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● 試劑盒組成：
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貨號
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產(chǎn)品名稱
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包裝
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RTP7102-01
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BCA試劑A
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100 ml
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RTP7102-02
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BCA試劑B
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3 ml
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BSA-01
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牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)溶液（5
mg/ml）
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2×1 ml
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RT0280-02
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PBS溶液
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10 ml
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說明書
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1份
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● 貯存、運(yùn)輸及效期：
試劑A和試劑B常溫溫貯存；牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液-20℃貯存；PBS溶液4℃貯存。試劑盒常溫運(yùn)輸；有效期1年。
● 產(chǎn)品簡介：
BCA蛋白濃度測定試劑盒的原理是蛋白質(zhì)分子中肽鍵結(jié)構(gòu)在堿性環(huán)境下能與Cu2+生產(chǎn)絡(luò)合物，并將Cu2+還原成Cu+，而BCA試劑可以特異性地與Cu+結(jié)合，形成穩(wěn)定的有顏色的復(fù)合物，并在562
nm處有最大的光吸收值，該復(fù)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，可以根據(jù)吸收值的大小來測定蛋白的含量。本試劑盒可以檢測500個(gè)樣品（使用微孔板）或50個(gè)樣品（使用試管）。
● 產(chǎn)品特點(diǎn)：
1.
靈敏度高，檢測濃度下限達(dá)到25 μg/ml（在20-1000
μg/ml濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系），最小檢測蛋白量達(dá)到0.2
μg，待測樣品體積為1-20
μl。
2.
BCA法測定蛋白濃度的最大優(yōu)點(diǎn)是蛋白濃度測定可以耐受高濃度的去垢劑，可以兼容樣品中高達(dá)5%的SDS，5%的Triton
X-100，5%的Tween
20, 60, 80。但受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響，需確保EDTA低于10 mM，無EGTA，二硫蘇糖醇（DTT）低于1 mM，β-巰基乙醇低于0.01%。具體參見五.干擾物質(zhì)附表。
● 操作方法
一．BCA工作液配制：
1.1 計(jì)算工作液總量：
工作液總量 =（BSA標(biāo)準(zhǔn)品樣本個(gè)數(shù)×復(fù)孔數(shù)+樣本個(gè)數(shù)×復(fù)孔數(shù)）×每個(gè)樣本工作液體積
以微板法舉例：
BSA 標(biāo)準(zhǔn)品樣本個(gè)數(shù)為8個(gè)，復(fù)孔數(shù)3個(gè)；待測樣本個(gè)數(shù)2個(gè)，復(fù)孔數(shù)2個(gè)。
顯色工作液總量 =
(8個(gè)BSA
標(biāo)準(zhǔn)品樣本×3＋2個(gè)待測樣本×2)×200
μl(每個(gè)工作液體積)=5.6
ml
注：由于加樣可能存在誤差，建議配制
BCA 工作液時(shí)，多配制
1~2 個(gè)孔的量。
1.2
按照計(jì)算出的所需工作液用量，將試劑A和試劑B按照體積比50:1比例混合，配成BCA工作液。如取6
ml 試劑A與0.12
ml試劑B混合，配成6.12
ml BCA工作液。兩者混合時(shí)會(huì)有沉淀形成，徹底混勻后沉淀消失，溶液應(yīng)為澄清藍(lán)綠色溶液。
注:新配制的BCA工作液常溫密封條件下可穩(wěn)定保存
24 h。
二．微孔板測定程序：（工作范圍20-1000
μg/ml）
2.1
蛋白標(biāo)準(zhǔn)品配制：常溫完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取60 μl 5 mg/ml BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液加240
μl PBS溶液，配制為300 μl終濃度為1
mg/ml BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液。
2.2
按照下表配制BSA標(biāo)準(zhǔn)測定溶液：
|
編號
|
0
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
|
BSA終濃度 μg/ml
|
0
|
25
|
50
|
100
|
200
|
400
|
800
|
1000
|
|
1mg/ml BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液 μl
|
0
|
2.5
|
5
|
10
|
20
|
40
|
80
|
100
|
|
PBS 溶液 μl
|
100
|
97.5
|
95
|
90
|
80
|
60
|
20
|
0
|
|
總體積 μl
|
100 μl
|
2.3
標(biāo)準(zhǔn)孔：取20 μl不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，加到微孔板中；
樣品孔：取適當(dāng)體積的待測樣品加入到微孔板中，并用PBS補(bǔ)足到20
μl。
2.4
向微孔板中加入200
μl BCA工作液，混勻，37℃放置30分鐘；
注：也可以常溫放置2小時(shí)。BCA法測定蛋白濃度時(shí)，顏色會(huì)隨著時(shí)間的延長不斷加深，并且顯色反應(yīng)會(huì)因溫度升高而加快，如果濃度較低，適合在較高溫度孵育，或適當(dāng)延長孵育時(shí)間。
2.5
測定562
nm 處的吸光值，并記錄讀數(shù)；以不含BSA
的樣品的光吸收值作為空白對照。
2.6 以BSA含量為縱坐標(biāo)， A562為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的蛋白濃度。如果所得到的蛋白濃度不在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，請稀釋樣品后重新測定。
三．試管測定程序：（工作范圍20-1000
μg/ml）
3.1蛋白標(biāo)準(zhǔn)品配制：常溫完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取60
μl 5 mg/ml BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液加240 μl PBS溶液，配制為300
μl終濃度為1 mg/ml BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液。
3.2在5
ml離心管中，按照下表配制BSA標(biāo)準(zhǔn)測定溶液：
|
編號
|
0
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
|
BSA終濃度 μg/ml
|
0
|
25
|
50
|
100
|
200
|
400
|
800
|
1000
|
|
1mg/ml BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液 μl
|
0
|
2.5
|
5
|
10
|
20
|
40
|
80
|
100
|
|
PBS 溶液 μl
|
100
|
97.5
|
95
|
90
|
80
|
60
|
20
|
0
|
|
總體積 μl
|
100 μl
|
3.3
將適當(dāng)體積的待測樣品加入到試管中，并用PBS補(bǔ)足到100
μl；
3.4
向標(biāo)準(zhǔn)管和樣品管中加入2 ml
BCA工作液，混勻，37℃放置30分鐘；
注：也可以常溫放置2小時(shí)。BCA法測定蛋白濃度時(shí)，顏色會(huì)隨著時(shí)間的延長不斷加深，并且顯色反應(yīng)會(huì)因溫度升高而加快，如果濃度較低，適合在較高溫度孵育，或適當(dāng)延長孵育時(shí)間。
3.5 取1
ml溶液加入到1
ml玻璃比色皿中，測定562
nm 處的吸光值，并記錄讀數(shù)；以不含BSA
的樣品的光吸收值作為空白對照。
3.6 以BSA含量為縱坐標(biāo)，A562為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的蛋白濃度。如果所得到的蛋白濃度不在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，請稀釋樣品后重新測定。
四．實(shí)驗(yàn)示例：
|
|
BSA標(biāo)準(zhǔn)品A562
|
BSA濃度
|
樣品A562
|
測定濃度
|
稀釋倍數(shù)
|
原始濃度
|
|
|
1
|
2
|
3
|
平均值
|
減去空白
|
ng/μl
|
減去空白
|
ng/μl
|
|
ng/μl
|
|
0
|
0.086
|
0.079
|
0.083
|
0.083
|
|
|
0.59
|
1068.7
|
×5
|
5344
|
|
1
|
0.094
|
0.089
|
0.093
|
0.092
|
0.009
|
25
|
0.309
|
555.7
|
×10
|
5557
|
|
2
|
0.109
|
0.106
|
0.115
|
0.11
|
0.027
|
50
|
|
|
|
|
|
3
|
0.145
|
0.147
|
0.151
|
0.148
|
0.065
|
100
|
|
|
|
|
|
4
|
0.205
|
0.202
|
0.205
|
0.204
|
0.121
|
200
|
|
|
|
|
|
5
|
0.307
|
0.318
|
0.32
|
0.315
|
0.232
|
400
|
|
|
|
|
|
6
|
0.52
|
0.513
|
0.53
|
0.521
|
0.438
|
800
|
|
|
|
|
|
7
|
0.623
|
0.619
|
0.659
|
0.634
|
0.551
|
1000
|
|
|
|
|
微孔板法：工作液總量 = (BSA標(biāo)準(zhǔn)品樣本個(gè)數(shù)×復(fù)孔數(shù)+樣本數(shù)×復(fù)孔數(shù))×樣本工作液體積=（8×3+2×1）×0.2 ml=5.2 ml；配制5.5
ml顯色工作液：5.5
ml試劑A加入0.11
ml 試劑B，混勻；按照操作步驟配制各種濃度BSA標(biāo)曲溶液100
μl，各取20 μl加到微孔板中；取待測樣品4
μl和2
μl，分別加16
μl 和18
μl 1×PBS（稀釋5倍和10倍），加到微孔板中；隨后加入顯色工作液200 μl，37℃ 20 min后讀數(shù)，吸光值為橫坐標(biāo)，BSA濃度為縱坐標(biāo)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=1825.8x-8.5089，R2=0.999，樣品蛋白濃度=5×（1825.8×0.59-8.5089）=5344
ng/μl=5.344 μg/μl或者樣品蛋白濃度=10×（1825.8×0.309-8.5089）=5557
ng/μl=5.557 μg/μl。
五．干擾物質(zhì)附表：
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化合物
|
耐受濃度
|
化合物
|
耐受濃度
|
化合物
|
耐受濃度
|
|
緩沖液
|
去垢劑和變性劑
|
還原劑
|
|
甘氨酸
|
1 M
|
CHAPS
|
5%
|
DTT
|
1 mM
|
|
Bicine
|
20 mM
|
鹽酸胍
|
4 M
|
β-巰基乙醇
|
0.01%
|
|
Bis-Tris
|
33 mM pH6.5
|
Triton X-100
|
5%
|
TCEP
|
不兼容
|
|
HEPES
|
0.1 M pH7.5
|
Triton X-114
|
1%
|
螯合劑
|
|
MES
|
50 mM
|
NP-10
|
5%
|
EDTA
|
10 mM
|
|
MOPS
|
50 mM
|
Tween 20
|
5%
|
EGTA
|
不兼容
|
|
檸檬酸鈉
|
200 mM pH4.8
|
SDS
|
5%
|
糖類
|
|
PIPES
|
50 mM
|
脫氧膽酸鈉
|
5%
|
葡萄糖
|
10 mM
|
|
TES
|
50 mM
|
尿素
|
3 M
|
蔗糖
|
40%
|
|
Tricine
|
25 mM pH8.0
|
鹽類
|
有機(jī)化合物
|
|
Tris-HCl
|
250 mM pH8.0
|
氯化鈉
|
1 M
|
甘油
|
10%
|
|
醋酸鈉
|
0.2 M pH5.5
|
硫酸銨
|
1.5 M
|
乙醇
|
10%
|
|
咪唑
|
50 mM pH7.0
|
酸堿
|
甲醇
|
10%
|
|
三乙醇胺
|
25 mM pH7.8
|
鹽酸
|
100 mM
|
DMSO
|
10%
|
|
磷酸鈉
|
100 mM
|
氫氧化鈉
|
100 mM
|
丙酮
|
10%
|
使用RTP7102 BCA蛋白定量試劑盒發(fā)表部分文章列表（12篇）
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Author: Chong Zhao,
Yuehua Liu, Zhuoping Liang, Huajun Feng & Sheng’en Xu
Journal: Biotechnology
& Biotechnological Equipment. Volume 33, 2019 - Issue 1
Institution： Affiliated Hospital of Southwest
Medical University
Paper link： https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/13102818.2019.1596041
2. [2022 IF=8.469]
Decreased ZNF750 promotes angiogenesis in a paracrine manner via activating DANCR/miR-4707-3p/FOXC2
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Author: Yanghui Bi,
Shixing Guo，Yongping Cui
Journal: Cell
Death & Disease (2020) 11:296
Institution：Shanxi Medical University
Paper link：https://doi.org/10.1038/s41419-020-2492-2
3. [2022 IF=1.6] Molecular
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condyloma acuminatum and penile squamous cell carcinoma.
Author: Yayu Hu,Xiaoli
Ren
Journal: Journal of International Medical Research (2021) 49(7) 1–13
Institution：Taizhou Municipal Hospital
Paper link：https://journals.sagepub.com/doi/10.1177/03000605211014379
4. [2022 IF=13.164]
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Gao, Hou-Ling Wang, Chengcheng Kan, Ze Li, Xiufen Yang,Weilun Yin, Xinli Xia,
Hong Gil Nam, Zhonghai Li, Hongwei Guo.
Journal: Molecular
Plant. 2021,20 July.
Institution：Beijing Forestry University, Beijing
Paper link：https://doi.org/10.1016/j.molp.2021.07.014
5. [2022 IF= ] Enhancing
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for Biodiesel Preparation.
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Journal: Research
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6. [2022 IF=4 ] The
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10. [2022 IF=2] Up-regulation of Trim28 in
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